低音提琴定弦方法复杂。目前通用的是四弦四度定弦：E2-A2-D1-G1。这样的定弦中，低音提琴能演奏的最低音为Kontra E。为了求得最低音与大提琴的八度关系，欧美的交响乐队都力争至少将低音提琴的最低音扩展至Kontra C。
具体而言，有两种方法可以做到：
流行于德奥等地的方法为增加第五弦。第五弦早期为C弦，这样第五弦与第四弦构成大三度，在指法上颇有不便，但C弦发音较易，张力上的要求在早期技术水准上容易达到。随着技术发展，德奥等地使用的第五弦一般为B弦，与第四弦构成纯四度，指法便利。弦的张力问题通过制琴技术发展也已解决。
流行于其他国家的方法是，为第四弦增加变调器，使在常规上发空弦E音的第四弦，经过变调后发C音。
除此以外，早期的低音提琴尚有3弦五度定弦法（一度流行与意大利等地的独奏低音提琴家）、3弦4度定弦法等等，今已淘汰。今日有少数低音提琴家主张4弦5度定弦（CGDA）。由于这种定弦要求演奏者的手足够大，且对传统的低音提琴指法、把位体系有彻底改动，因此尚未流行开。
